2022高考生物（山東版）一輪總復習專題26基因工程與生物技術的安全性和倫理問題專題檢測（有解析）

專題26　基因工程與生物技術的安全性和倫理問題專題檢測A組一、單項選擇題1.(2020屆浙江七彩陽光高三聯考,9)若要使目的基因在受體細胞中表達,需要通過質粒等載體導入受體細胞而不能直接將目的基因導入受體細胞,其原因不包括(　　)A.目的基因無法插入受體細胞DNAB.目的基因無法復制C.目的基因無轉錄所需的啟動部位D.目的基因與受體細胞遺傳信息傳遞方式不同答案　D　目的基因無法插入受體細胞DNA,也無法完成復制,且缺少轉錄所需的啟動部位,因此需要借助質粒等載體導入受體細胞,而目的基因與受體細胞遺傳信息傳遞方式相同,這不是需要借助質粒等載體的原因,D符合題意。2.(2020屆5·3改編)下面是4種限制酶所識別的DNA分子序列和剪切位點(↓表示剪切點、切出的斷面為黏性末端):限制酶1:—↓GATC—。限制酶2:—CATG↓—。限制酶3:—G↓GATCC—。限制酶4:—CCGC↓GG—。請指出下列哪項表達正確(　　)A.在使用限制酶的同時還需要解旋酶B.限制酶1和3剪出的黏性末端相同C.限制酶1、2、4識別的序列都由4個脫氧核苷酸組成D.限制酶1和2切出的DNA片段可通過T4DNA連接酶拼接答案　B　使用限制性核酸內切酶是為了切割目的基因和載體,不需要解旋酶解開DNA雙螺旋,A錯誤;限制性核酸內切酶1和3切出的黏性末端相同,都是GATC—,B正確;限制性核酸內切酶1、2識別的序列都由4個脫氧核苷酸組成,限制酶3、4識別的序列都由6個脫氧核苷酸組成,C錯誤;限制性核酸內切酶1和2切割形成的DNA片段的黏性末端不同,前者是GATC—,后者是—CATG,不能通過T4DNA連接酶拼接,D錯誤。3.(2020浙江寧波一模,25)為獲得抗病毒的馬鈴薯植株,采用轉基因技術將病毒復制酶基因轉移到馬鈴薯體內。下列相關敘述正確的是(　　)A.該轉基因馬鈴薯植株產生的配子中,一定含有目的基因B.將目的基因導入植物細胞可用農桿菌轉化法或顯微注射法C.由愈傷組織產生胚狀體后再萌發形成完整植株的過程需要生根培養基D.轉化了的馬鈴薯細胞在合適條件下經脫分化即可形成抗病毒馬鈴薯植株答案　B　若只將目的基因整合到馬鈴薯細胞的一條染色體上,則通過減數分裂產生的配子中不一定含有目的基因,A錯誤;將目的基因導入植物細胞可用農桿菌轉化法或顯微注射法,B正確;由愈傷組織產生胚狀體后再萌發形成完整植株的過程不需要生根培養基,C錯誤;轉化了的馬鈴薯細胞在合適條件下經脫分化和再分化形成抗病毒馬鈴薯植株,D錯誤。4.(2018江蘇揚、通、泰、徐、淮、宿二模,20)農桿菌中的Ti質粒是植物基因工程中常用的載體,相關敘述正確的是(　　)A.Ti質粒是能夠自主復制的單鏈DNA分子B.Ti質粒中磷酸基團都與兩個脫氧核糖相連接C.重組Ti質粒的受體細胞只能是植物愈傷組織細胞D.Ti質粒上的基因可全部整合到受體細胞染色體上答案　B　Ti質粒是能夠自主復制的環狀雙鏈DNA分子,其分子內部的磷酸基團都與兩個脫氧核糖相連接,A錯誤,B正確;重組Ti質粒的受體細胞可以是植物愈傷組織細胞,,也可以是植物的其他細胞,C錯誤;農桿菌有Ti質粒,Ti質粒上有一段T-DNA,目的基因可插入Ti質粒上的T-DNA中,從而導入農桿菌,讓農桿菌侵染植物,農桿菌的Ti質粒上的T-DNA片段(內有目的基因)整合到受體細胞的染色體上,即只有Ti質粒上的T-DNA片段(內有目的基因)而不是Ti質粒上的全部基因可整合到受體細胞染色體上,D錯誤。誤區警示　環狀的雙鏈DNA分子中沒有游離的磷酸基團,而鏈狀的雙鏈DNA分子中有2個游離的磷酸基團,分別分布在單鏈的一端。5.(2020海南調研,20)某實驗小組將人生長激素基因導入大腸桿菌以制備工程菌,下列相關敘述正確的是(　　)A.人生長激素基因可以通過以下丘腦細胞的mRNA為模板的反轉錄獲得B.將人的生長激素基因導入大腸桿菌常采用Ca2+處理細胞C.利用工程菌制備的生長激素和人體細胞合成的具有相同的空間結構D.在生長激素基因的首端插入終止子的目的是保證目的基因成功轉錄答案　B　人的生長激素mRNA只能從人的垂體細胞中提取,下丘腦細胞生長激素基因不表達,A錯誤;用Ca2+處理大腸桿菌可使大腸桿菌成為易于吸收周圍環境中DNA分子的狀態,B正確;生長激素屬于分泌蛋白,人體細胞合成的生長激素需要經過內質網和高爾基體的加工,工程菌內沒有內質網和高爾基體,故人體細胞和工程菌內合成的生長激素的空間結構不同,C錯誤;為保證生長激素基因的正常轉錄,表達載體中目的基因的首端應有啟動子,尾端應有終止子,D錯誤。6.(2019江蘇南京、鹽城二模,17)下列關于生物學中常見的幾種酶的敘述,正確的是(　　)A.DNA連接酶將目的基因的黏性末端與載體的黏性末端之間的堿基黏合B.用限制性核酸內切酶從質粒上切下一個目的基因需消耗4個水分子C.Taq酶是PCR儀擴增DNA分子時常用的一種耐高溫的DNA連接酶D.在解離根尖分生區細胞時加入纖維素酶有利于提高解離的效果答案　B　黏性末端與黏性末端之間的互補配對的堿基自動形成氫鍵,DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵,A錯誤;切下一個目的基因需要打開2個切口,水解4個磷酸二酯鍵,故需消耗4個水分子,B正確;Taq酶是耐高溫的DNA聚合酶,C錯誤;對根尖分生區細胞進行解離時用解離液處理,不需要纖維素酶,D錯誤。7.(2020浙江稽陽聯考,11)如圖是基因文庫的構建和獲取目的基因的示意圖。下列敘述正確的是(　　)A.通過該途徑獲得的目的基因,通常是序列已知的B.①過程通常只用一種DNA酶切割全部DNAC.③過程需用CaCl2處理,使大腸桿菌細胞壁的通透性增加D.④過程可用相應抗體,利用核酸分子雜交技術釣取目的基因答案　C　通過該途徑獲得的目的基因,通常是序列未知的,A錯誤;①過程要用限制性核酸內切酶切割全部DNA,B錯誤;③過程需用CaCl2處理,使大腸桿菌細胞壁的通透性增加而成為感受態細胞,C正確;④過程可利用核酸分子雜交技術釣取目的基因,但不能用抗體,D錯誤。8.(2019江蘇蘇、錫、常、鎮三模,15)科研人員利用CRISPR/Cas9技術敲除了生物節律核心基因BMAL1,獲得了具有睡眠紊亂癥狀的獼猴,取其中一只獼猴的體細胞又克隆了5只BMAL1基因敲除的克隆猴,用作睡眠障礙等疾病的藥物研發模型。下列敘述錯誤的是(　　)A.該研究涉及的現代生物技術有基因工程、核移植、胚胎工程B.不用鼠作藥物研發模型的原因是鼠晝伏夜出的生活習性與人相反C.BMAL1基因只存在于下丘腦細胞并可在下丘腦細胞中表達D.用這5只克隆猴作模型是因為它們基因型等遺傳背景一致,答案　C　本題主要考查生命觀念中的結構與功能觀。分析題干信息可知,上述研究涉及了利用基因工程的工具酶敲除生物節律核心基因BMAL1,克隆獼猴時需利用核移植技術,另外還需要將早期胚胎移植到子宮,這又涉及了胚胎工程,A正確;由于鼠的習性與人不同,特別是它的晝伏夜出的生活習性與人相反,因此鼠不適合用作睡眠障礙等疾病的藥物研發模型,而用克隆猴作模型是因為它們基因型等遺傳背景一致,B、D正確;下丘腦與生物節律有關,可推測BMAL1基因在下丘腦中表達,但并非該基因只存在于下丘腦,C錯誤。二、非選擇題9.(2020屆浙江嘉興高三9月測試,30)(8分)人的S細胞可以產生某種具有臨床價值的蛋白質,該蛋白質由基因yie編碼。目前可利用現代生物技術生產該蛋白質?；卮鹣铝袉栴}:(1)要獲得yie基因,可從人的S細胞中提取　　　　作為模板,在逆轉錄酶的催化下合成互補DNA,再利用　　　　技術在體外擴增獲得大量yie基因。 (2)通過農桿菌轉化可將yie基因導入某種植物的葉肉細胞中。若該葉肉細胞經培養、篩選等得到了yie基因能穩定表達的愈傷組織,則說明yie基因已經　　　　　　　　　　　　　　　。把愈傷組織放在搖床上,通過　　　　培養可以獲得單細胞,這種單細胞具有　　　　細胞的特征,最終可以形成植株。 (3)也可將yie基因通過　　　　法注入植物的原生質體。為獲取原生質體,需要制備含　　　　　　　酶以及滲透壓穩定劑、細胞膜保護劑等的反應液。將外植體放入反應液后要嚴格控制好溫度、pH和　　　　,避免脆弱的原生質體受到持續的傷害。 答案　(8分,每空1分)(1)mRNA　PCR(2)整合到葉肉細胞的染色體DNA上　液體懸浮　胚性　(3)顯微注射　纖維素酶和果膠　反應時間解析　(1)要獲得yie基因,可從人的S細胞提取mRNA作為模板,在逆轉錄酶的催化下合成互補DNA,再利用PCR技術在體外擴增獲得大量yie基因。(2)愈傷組織能穩定表達yie基因,說明yie基因已經整合到葉肉細胞的染色體DNA上。愈傷組織在搖床上通過液體懸浮培養可以獲得單細胞,這種單細胞具有胚性細胞的特征,最終可以形成植株。(3)yie基因通過顯微注射法注入植物的原生質體。原生質體的獲得要制備含纖維素酶和果膠酶以及滲透壓穩定劑、細胞膜保護劑等的反應液。外植體放入反應液后要嚴格控制好溫度、pH和反應時間。10.(2020浙江紹興一模,29)(8分)如圖是基因文庫的構建示意圖。請回答下列問題。(1)獲取目的基因時,如果目的基因的　　　　　是未知的,可以建立一個包括目的基因在內的基因文庫,再從基因文庫中獲得目的基因。對于高等動植物復雜的染色體DNA來說,單個基因所占比例極小,將其分離出來并非易事,一般需要先對DNA進行　　　　,以產生足夠多的數量。 (2)如圖所示基因文庫用克隆載體構建,載體中目的基因可通過細菌的　　　　完成片段的克隆。從基因文庫中分離目的基因時主要利用核酸探針,核酸探針在基因工程的操作過程中還有很多方面的應用,如檢測目的基因是否導入受體細胞,以及　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 ,(3)培育轉基因羊時,可利用顯微注射法將從基因文庫中獲得的目的基因導入　　　　(受體)細胞,再經過　　　　　　　,移植到　　　　的發情母羊的輸卵管或子宮角。目的基因在受體細胞中的整合率不太穩定,這除與注射的位置和時間有關外,還要考慮目的基因的構型和　　　　。 答案　(1)核苷酸序列　擴增　(2)繁殖?、贆z測目的基因是否插入受體細胞的染色體DNA中;②檢測目的基因是否轉錄出mRNA(答對1點即可)　(3)受精卵　胚胎體外培養　未經配種　濃度解析　(1)獲取目的基因時,如果目的基因的核苷酸序列是未知的,可以通過建立基因文庫并從中獲取。由于單個基因占比很小,需要對DNA進行擴增,以便產生足夠多的數量用于實驗。(2)基因文庫的基因可通過細菌的繁殖完成克隆。核酸探針除了可以從基因文庫中調取目的基因,還可以檢測目的基因是否導入受體細胞,檢測目的基因是否插入受體細胞的染色體DNA中,檢測目的基因是否轉錄出mRNA。(3)培育轉基因羊時,利用顯微注射法可將目的基因導入受精卵細胞,再通過胚胎體外培養,移植到未經配種的發情母羊的輸卵管或子宮角。目的基因在受體細胞中的整合率不太穩定的原因與注射時間和位置、目的基因的構型和濃度等有關。11.(2020遼寧大連一模,38)(10分)微衛星DNA是廣泛分布于真核生物基因組中的簡單重復序列。由于重復單位的重復次數在個體間呈高度特異性并且數量豐富,因此,微衛星DNA可以作為分子標記,并有著廣泛應用。(1)為了分離捕獲到某種生物的微衛星DNA分子標記,可以用生物素標記的特定簡單重復序列作為探針,與該生物的　　　　文庫進行雜交,然后再經多個步驟篩選獲取微衛星DNA。 (2)擴增分離到的微衛星DNA序列的PCR反應體系中含緩沖液、模板DNA、dNTP(包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物及熱穩定DNA聚合酶等。其中dNTP的作用是　　　　　　　　　　　　　　;該技術的前提是　　　　　　　　　　　,以便根據這一序列合成引物,所以引物應選用圖中　　　　(填圖中標號)。 (3)PCR的基本反應步驟為　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,其產物量以　　　　形式擴增。 (4)根據“微衛星DNA”的特點判斷,這種分子標記可應用于　　　　(填字母)。 A.人類親子鑒定　　　　　B.種群遺傳多樣性研究C.誘導基因突變D.冠狀病毒遺傳物質測序答案　(1)基因組　(2)合成DNA的原料、提供能量　有一段已知目的基因的核苷酸序列?、窈廷簟?3)DNA解鏈—引物結合到互補鏈—互補鏈的合成(或變性、復性/退火、延伸或高溫解鏈—冷卻引物結合—加熱互補鏈合成)　指數(約為2n)　(4)AB解析　(1)由于微衛星DNA是簡單重復序列,可以用生物素標記的特定簡單重復序列作為探針,與該生物的基因組文庫進行雜交,然后再經多個步驟篩選獲取微衛星DNA。(2)dNTP在PCR過程中作為合成DNA分子的原料和提供能量。PCR技術的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根據這一序列合成引物,這兩個DNA引物分別與目的基因雙鏈各一端序列相互補,所以引物應選用圖中Ⅰ和Ⅳ。(3)PCR的反應步驟為目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈,引物與單鏈相應互補序列結合,然后在DNA聚合酶作用下進行延伸,如此重復循環,因而每一次循環后目的基因的量可以增加一倍,即成指數形式擴增(約為2n,其中n為擴增循環的次數)。PCR技術的步驟可簡單概括為變性、復性/退火、延伸。(4)微衛星DNA是真核生物基因組中的簡單重復序列,且重復單位的重復次數在個體間呈高度特異性,因此可用于人類親子鑒定、物種間親緣關系鑒定、遺傳多樣性的研究等,A、B正確;誘導基因突變的因素有物理因素、化學因素和生物因素,與微衛星DNA的特性無關,C錯誤;冠狀病毒的遺傳物質是RNA,其測序不能用微衛星DNA進行標記,D錯誤。12.(2020浙江臺州一模,30)現代生物技術在醫藥、農業等領域都有廣泛應用?；卮鹣铝袉栴}:(1)將人體中B蛋白基因導入大腸桿菌,以生產藥物B蛋白。,①由于人體基因的轉錄初始產物需切除部分序列,才能加工成為成熟的mRNA,因此直接將從人類基因文庫中獲取的B蛋白基因導入大腸桿菌,B蛋白基因無法正常表達?？刹捎谩　　　　　　　　〉姆椒ê铣葿蛋白基因,以解決這一問題。 ②導入過程所用載體pUC19質粒如圖所示,LacZ基因表達產物能水解X-gal,使菌落呈藍色,不能水解X-gal的菌落呈白色。已知三種限制性核酸內切酶X、Y、Z所識別的序列分別是C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC(↓表示剪切點)。為便于篩選導入重組質粒的大腸桿菌,應選用的限制性核酸內切酶是　　　,并且在培養基中加入　　　　　　　　,接種培養后選擇　　　色菌落。 ③篩選得到成功導入B蛋白基因的大腸桿菌菌株,為檢驗B蛋白基因是否表達,可以用含放射性標記的B蛋白基因單鏈作為探針,檢測受體菌是否　　　　　　。 (2)現代生物技術應用于農作物育種,也取得可喜成績。利用基因工程育種技術可培育轉基因農作物。在此過程中,為成功獲得新植株,應選擇性狀優良、　　　　　　　　　　　作為受體材料。除此之外,影響受體材料能否成功再生出新植株的因素還有光溫條件、植物生長調節劑及　　　　　的配比。利用多倍體育種技術或者　　　　　技術則可培育異源多倍體。 答案　(1)①提取mRNA進行逆轉錄(或人工合成、化學合成)?、赮　氨芐青霉素、X-gal(寫全給分)　白?、鄢晒D錄(合成相應RNA)　(2)全能性表達充分的基因型　營養物質　植物體細胞雜交(植物細胞工程)解析　(1)①人體基因轉錄的mRNA需要加工為成熟的mRNA用于翻譯,所以人體基因直接導入大腸桿菌無法正常表達。采用提取成熟的mRNA進行逆轉錄的方法合成相應目的基因(或化學合成)可以解決這個問題。②LacZ基因表達產物能水解X-gal,使菌落呈藍色,不能水解X-gal的菌落呈白色,因此可通過LacZ基因是否完整來判斷目的基因是否插入質粒,選擇的限制性核酸內切酶應是Y,并且在培養基中加入氨芐青霉素、X-gal,接種培養后選擇白色菌落。③為檢驗B蛋白基因是否表達,可用含放射性標記的B蛋白基因單鏈作為探針,檢測受體菌有無合成相應的RNA。(2)轉基因植株培育中,要選擇性狀優良、全能性表達充分的基因型作為受體材料,培育條件應為適宜的光照溫度、植物生長調節劑以及營養物質的配比。利用多倍體育種技術或者植物體細胞雜交技術可培育異源多倍體。13.(2019江蘇南京、鹽城二模,33)(15分)圖甲為構建重組質粒過程中的三種備選質粒,其中Ap為氨芐青霉素抗性基因,Tc為四環素抗性基因。圖乙為培育轉AFPs基因(抗凍基因)番茄的示意圖,外源DNA和質粒上均標出了酶切位點及相關抗性基因,請回答下列問題。甲乙(1)圖甲中通常選用質粒C構建重組質粒,而不選用質粒A或質粒B的原因分別是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (2)據圖乙分析,若需使用插入失活法篩選并鑒定重組質粒,應優先選用限制酶　　　　　　　切割目的基因和質粒。 ,(3)通過PCR技術獲取目的基因時需設計　　　　種引物;從cDNA文庫中獲得的目的基因　　　　(填“含有”或“不含有”)啟動子和終止子。 (4)在構建基因表達載體過程中常把兩個啟動子串聯在一起形成雙啟動子,加在目的基因上游。雙啟動子的作用可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (5)圖乙農桿菌中的質粒應含有T-DNA,其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。若要獲得抗凍能力更強的抗凍番茄,可以對AFPs基因進行改造,最終得到相應的蛋白質,該過程需用到　　　　工程。 (6)為使改造后的AFPs基因能夠表達,人工設計質粒D并對它的多個酶切位點進行研究。若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨切割質粒D,均獲得一條長鏈,若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割,則獲得2個500bp和1個2666bp片段,若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割,則獲得2個250bp和1個3166bp片段。若以HindⅢ酶切割位點為計算起點,則KpnⅠ酶切割位點與HindⅢ酶切割位點最短長度為　　　　,EcoRⅠ酶的兩個切割位點與HindⅢ切割位點的最短距離為　　　　。 答案　(1)質粒A中沒有標記基因,質粒B的復制原點中含有HindⅢ酶切位點　(2)BamHⅠ和HindⅢ　(3)2　不含有　(4)保證目的基因的高效轉錄(高效表達)　(5)攜帶目的基因進入番茄細胞并整合到番茄細胞的染色體DNA上蛋白質　(6)750bp　500bp解析　(1)(4)(5)見答案。(2)圖乙中,選用的質粒C作為基因工程的載體,結合目的基因兩端的酶切位點,可以選擇BamHⅠ和HindⅢ同時切割目的基因和載體,或者EcoRⅠ和HindⅢ同時切割,若需使用插入失活法篩選并鑒定重組質粒,應優先選用限制酶BamHⅠ(會破壞Tc)和HindⅢ切割,可以根據是否對四環素有抗性來篩選。(3)PCR擴增目的基因需設計2種引物來確保DNA兩條鏈同時擴增,cDNA由mRNA反轉錄而來,所以從cDNA文庫中獲得的目的基因不含有啟動子和終止子。(6)若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨切割質粒D,均獲得一條長鏈,說明該質粒上只含有HindⅢ酶的1個切割位點和KpnⅠ酶的1個切割位點。若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時切割,則獲得2個500bp和1個2666bp片段,若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時切割,則獲得2個250bp和1個3166bp片段,說明該質粒上有2個EcoRⅠ酶切割位點,且兩個位點之間的最短距離是500bp,而KpnⅠ酶的切割位點在2個EcoRⅠ酶切割位點之間,且距離每個EcoRⅠ酶的切割位點250bp,HindⅢ酶切割位點距離EcoRⅠ酶切割位點的最短距離是500bp,KpnⅠ酶切割位點與HindⅢ酶切割位點最短長度為250+500=750bp,EcoRⅠ酶的兩個切割位點與HindⅢ切割位點的最短距離為500bp。名師點睛　標記基因的作用篩選和鑒定受體細胞中是否含有目的基因,故構建基因表達載體時需要保證至少一個標記基因的完整性。14.(2020屆浙江溫麗地區高三一模,30)(10分)研究發現,PVY-CP基因位于某種環狀DNA分子中。將PVY-CP基因導入馬鈴薯,使之表達即可獲得抗PVY病毒的馬鈴薯。如圖表示PVY-CP重組質粒的構建過程,相關酶切位點如表。BamHⅠHindⅢBglⅡSmaⅠSau3AⅠ↓　　　GGATCCCCTAGG　　　↑↓　　　AAGCTTTTCGAA　　　↑↓　　　AGATCTTCTAGA　　　↑↓CCCGGGGGGCCC↑↓　　　GATCCTAG　　　↑(1)步驟②選用的klenow酶與細胞內的　　　　　(填酶的名稱)的功能相似。步驟④應選用的限制性核酸內切酶是　　　　。 ,(2)若BamHⅠ酶切的粘性末端與BglⅡ酶切的粘性末端連接,連接部位的6個堿基對序列為　　　　　　,對于該部位,這兩種酶　　　　(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。 (3)若用Sau3AⅠ切圖中所示的質粒(多個),最多可能獲得　　　　種大小不同的DNA片段。 (4)步驟⑤獲得的重組質粒通過農桿菌轉入馬鈴薯的原生質體,并誘導形成細胞壁,再轉入　　　　(A.細胞分裂素多,生長素少　B.細胞分裂素少,生長素多　C.細胞分裂素和生長素比例適合　D.細胞分裂素中等,生長素少)的培養基中培養,形成　　　　,再進行生根培養,獲得轉基因馬鈴薯。 (5)可用　　　　　　的方法,從個體水平檢測馬鈴薯植株中PVY-CP基因是否成功表達。 答案　(1)DNA聚合酶　BglⅡ和SmaⅠ　(2)—GGATCT——CCTAGA—(或—AGATCC——TCTAGG—)　都不能　(3)7　(4)A　叢狀苗　(5)PVY病毒感染解析　(1)圖示過程②,klenow酶將DNA片段的粘性末端補平,因此相當于DNA聚合酶的作用。步驟④將目的基因和質粒連接起來,目的基因一端是BamHⅠ剪切后的粘性末端,另一端是平末端,要將目的基因按照轉錄方向正確連接,需要用BglⅡ和SmaⅠ剪切。(2)BamHⅠ酶切后的粘性末端與BglⅡ酶切的粘性末端相連,連接部位為—GGATCT——CCTAGA—(或—AGATCC——TCTAGG—,對此片段這兩種酶都不能切開,體現了酶的專一性。(3)若用Sau3AⅠ切割圖示的多個質粒,由于存在3個酶切位點,最多能產生7種大小不同的DNA片段。(4)原生質體誘導形成細胞壁,再轉入細胞分裂素多、生長素少的的培養基中,培養形成叢狀苗,再進行生根培養。(5)要檢測PVY-CP基因是否成功表達,可用PVY病毒感染轉基因馬鈴薯檢測其是否有抗性。專題檢測B組一、單項選擇題1.(2020山東師大附中4月模擬,14)基因工程培育的“工程菌”通常經發酵工程生產的產品有(　　)①石油?、谌松L激素?、圩喜菟亍、芫垡叶肌、菀葝u素?、拗亟M乙肝疫苗　　　　　　　　　　　　　　　　　　　A.①③⑥B.②⑤⑥C.③⑤⑥D.②③⑤答案　B　石油是從地層中獲得的,①錯誤;人生長激素的化學本質是蛋白質,可以通過基因工程培育的“工程菌”發酵獲得,②正確;紫草素是植物組織培養技術獲得的,③錯誤;聚乙二醇是由環氧乙烷聚合而成的,這是一個化學反應,不需要用基因工程培育的“工程菌”,④錯誤;胰島素的化學本質是蛋白質,可以通過基因工程培育的“工程菌”發酵獲得,⑤正確;重組乙肝疫苗的化學本質是蛋白質,可以通過基因工程培育的“工程菌”發酵獲得,⑥正確。2.(2018北京海淀期中,29)科研人員通過PCR技術獲得肝細胞特異性啟動子——白蛋白啟動子,將該啟動子與Cre重組酶基因結合構建表達載體,培育出在肝細胞特異性表達Cre重組酶的轉基因小鼠。下列敘述正確的是(　　)A.將該表達載體導入肝細胞以獲得轉基因小鼠B.PCR技術獲得白蛋白啟動子需設計特異性的引物C.構建該表達載體需要限制酶和DNA聚合酶D.通過核酸分子雜交技術檢測目的基因是否完成表達答案　B　將表達載體導入肝細胞無法獲得轉基因小鼠個體,應將表達載體導入受精卵,后者可以發育成新的個體,A選項錯誤。根據堿基互補配對原則,需設計特異性引物才能通過PCR技術獲得白蛋白啟動子,B選項正確。構建該表達載體需要限制酶和DNA連接酶,不需要DNA聚合酶,C選項錯誤。通過核酸分子雜交技術只能檢測目的基因是否轉入(運用DNA-DNA分子雜交技術)以及目的基因是否轉錄(運用DNA-RNA分子雜交技術),檢測是否表達,需要檢測蛋白質,故用抗原—抗體雜交技術,D選項錯誤。,3.(2019江蘇南通、連云港等七市三模,17)科學家構建了含有大洋鱈魚抗凍蛋白基因啟動子和大鱗鮭魚生長激素基因的表達載體,并將其導入了大西洋鮭的細胞中,獲得了生長速度加快的轉基因大西洋鮭。相關敘述正確的是(　　)A.轉基因大西洋鮭體內抗凍蛋白明顯增加B.構建基因表達載體需要限制酶和DNA聚合酶C.大鱗鮭魚生長激素基因不能通過PCR技術擴增獲得D.轉基因大西洋鮭生長激素含量增加導致生長速度加快答案　D　根據題干信息轉基因大西洋鮭體內并不含有大洋鱈魚的抗凍蛋白基因,因此體內抗凍蛋白不會明顯增多,A錯誤;構建基因表達載體需要限制酶和DNA連接酶,不需要DNA聚合酶,B錯誤;通過PCR方法擴增,可獲得大鱗鮭魚生長激素基因,C錯誤;轉基因大西洋鮭體內的大鱗鮭魚生長激素基因表達,生長激素含量增加導致生長速度加快,D正確。易錯警示　審題不嚴密,易犯粗心大意的錯誤,認為轉基因大西洋鮭轉入了大洋鱈魚抗凍蛋白基因,題干中給出的信息只是轉入了大洋鱈魚抗凍蛋白基因的啟動子,而不是抗凍蛋白基因。4.(2019江蘇無錫一模,17)下列關于基因工程的敘述,正確的是(　　)A.構建表達載體時需要在目的基因前加上起始密碼子B.農桿菌轉化法可以將目的基因隨機插入受體細胞的染色體DNAC.標記基因中不能有限制酶的識別位點以防止其被破壞而失去作用D.導入人胰島素基因的大腸桿菌可直接生產出有活性的人胰島素答案　B　本題考查學生對基因工程的基本操作程序的相關知識的識記和理解能力。構建基因表達載體時需要在目的基因前加上啟動子,A錯誤;采用農桿菌轉化法,可以將目的基因隨機插入受體細胞的染色體DNA上,B正確;標記基因中可以有限制酶的識別位點,為了防止標記基因被破壞而失去作用,在構建基因表達載體時,使用的限制酶應該不具有識別標記基因中的限制酶的識別位點的能力,C錯誤;導入人胰島素基因的大腸桿菌,因沒有內質網和高爾基體,不能對胰島素進行加工,所以不能直接生產出有活性的人胰島素,D錯誤。5.矮牽?；ò曜仙纳顪\由花青素的含量高低決定,花青素由查耳酮合酶(CHS)催化合成,為獲得紫色更深的矮牽牛,科研人員將CHS基因導入野生型紫花矮牽牛葉肉細胞中,得到的轉基因植株花色反而出現了淺紫色,檢測CHS基因的轉錄水平,得到如圖所示電泳圖譜(2道和3道分別表示野生型和轉基因植株)。下列判斷正確的是(　　)A.用不同的限制酶處理含CHS基因的DNA和運載體B.轉基因植株中內源CHS基因的轉錄水平明顯低于野生型C.轉基因植株內外源CHS基因的轉錄均被抑制D.沒有獲得紫色更深的植株是因為CHS基因沒有成功轉入答案　B　用相同的限制酶組合(都選用固定的兩種黏性末端不同的限制酶)處理含CHS基因的DNA和運載體,使兩者含有相同的粘性末端,以便兩者構建重組分子,A錯誤;由圖分析2道野生型內源的條帶較粗,而3道轉基因內源的條帶較細,說明轉基因植物的內源基因的轉錄水平明顯低于野生型,B正確;轉基因植株內源CHS基因的轉錄被抑制,外源CHS基因的轉錄正常,C錯誤;從圖中看到,,外源基因轉入成功,沒有獲得紫色更深的植株可能是因為轉基因植株內源CHS基因表達被抑制,轉基因植株外源CHS基因和內源CHS基因的綜合表達量沒有野生型的內源CHS基因表達量高,D錯誤。6.(2020浙江超級全能生聯考,27)某一品系的棉花野生型植株既不抗蟲也不抗除草劑,如圖為構建轉基因植株M(抗蟲、抗除草劑)的過程示意圖,有關敘述錯誤的是(　　)A.采用Ti質粒作為載體的優勢是其具備可轉移至受體細胞的T-DNAB.為防止自身環化及相互連接,準備工作①中應至少使用4種不同的限制酶C.過程⑤可能依次經歷了細胞團、球形胚、心形胚、胚狀體、完整植株的過程D.基因A、B可能插入到細胞M的染色體上,但不可能同時存在于同一條染色體上答案　D　本題中轉基因植物的培育采用了典型的農桿菌轉化法,Ti質粒作為載體的優勢是其T-DNA可轉移至受體細胞,A正確;為防止自身環化,切割目的基因兩端的限制酶應是不同的,又要防止基因A、B的相互連接,因此準備工作①中至少需要4種不同的限制酶,B正確;處于適當的液體培養條件的單個植物細胞,經過培養基中成分的誘導,可依次經歷從單細胞到細胞團、球形胚、心形胚、胚狀體、完整植株的過程,C正確;植株M自交后,抗蟲∶不抗蟲=15∶1,抗除草劑∶不抗除草劑=15∶1,說明植株M的2對染色體上插入了2個A基因和2個B基因,各自符合自由組合定律,又因為后代未出現野生型植株,說明一對同源染色體的兩條染色體上,分別插入了A和B基因,而另一對同源染色體,有兩種情況:可能A、B兩個基因都插入到了一條染色體上,也可能分別插入到兩條染色體上,以上兩者情況均會導致14∶1∶1的結果,植株M的基因型示意圖如圖:綜上所述,D錯誤。二、非選擇題7.[2019浙江新高考研究聯盟聯考,32(二)](7分)回答與基因工程和動物克隆有關的問題。(1)以人基因組DNA為模板,采用　　　　　擴增人胰島素原基因,然后將其與含有標記基因的載體用相同的　　　　　　　　　切割之后,用DNA連接酶將目的基因和載體連接在一起形成重組DNA分子。 (2)若要利用轉基因動物的乳腺來生產人胰島素,則可將重組DNA分子用　　　　　的方法導入動物的受精卵中,受精卵在體外培養到　　　　　　　　　階段,再移植到代孕母體的　　　　　　　　　,之后著床、并繼續生長發育。也可以將重組DNA分子先導入動物的體細胞中,再通過是否含有標記基因來篩選出含有人胰島素原基因的體細胞,然后在一定物質的介導下使其與去核卵細胞進行　　　　　　　　　　形成一個重建的“合子”,經過胚激活、胚胎培養和胚胎移植后得到轉基因動物。 (3)相比細菌基因工程,以轉基因動物的乳腺作為反應器來生產人胰島素的優點是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 答案　(1)PCR技術　限制性核酸內切酶　(2)顯微注射　早期囊胚　子宮角或輸卵管　細胞融合(或融合)　(3)乳腺細胞可以將無生物活性的胰島素原蛋白加工成有生物活性的胰島素解析　(1)目的基因可采用PCR技術進行大量擴增;對目的基因和載體用相同的限制性核酸內切酶進行切割,產生相同的末端,再用DNA連接酶進行連接形成重組DNA分子。(2)將目的基因導入動物細胞常采用顯微注射法,當受精卵在體外培養到早期囊胚時,再移植到代孕母體的子宮角或輸卵管,之后,胚胎在子宮著床,并繼續生長發育。利用動物細胞來生產人的胰島素,也可將重組DNA先導入動物的體細胞,再篩選出含有人胰島素原基因的體細胞,然后在一定物質的介導下使其與去核卵母細胞進行融合,經胚激活、胚胎移植后得到轉基因動物。(3)細菌中無內質網、高爾基體等細胞器,因此通過細菌基因工程生產的人的胰島素沒有生物學活性而轉基因動物的乳腺細胞可以將無生物活性的胰島素原蛋白加工成有生物活性的胰島素。8.(2020福建三明二模,38)(10分)糖尿病是一種常見病,其發病率呈逐年上升的趨勢,治療糖尿病少不了胰島素。如圖表示運用基因工程技術生產胰島素的幾條途徑,請據圖回答下列問題:(1)圖中過程①為　　　　　　　　　　　,在此之前可以根據　　　　　　　　　　　　　設計引物,利用PCR技術對目的基因進行擴增。將重組質粒M轉移到受體細胞A中常用的方法是　　　　　　　。 (2)過程②可用的方法是　　　　　　　　　。過程③用到的技術手段有　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (3)若該轉基因“胰島素羊”乳汁中檢測到胰島素,該胰島素與轉基因“胰島素大腸桿菌”產生的胰島素相比,不同之處是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 答案　(1)構建基因表達載體　人胰島素基因的核苷酸序列　顯微注射法　(2)農桿菌轉化法(或基因槍法或花粉管通道法)　早期胚胎培養、胚胎移植　(3)“胰島素羊”乳腺細胞分泌的胰島素具有生物活性,而轉基因“胰島素大腸桿菌”產生的胰島素無生物活性　乳腺細胞有內質網與高爾基體,能加工相關的蛋白質,而大腸桿菌沒有內質網和高爾基體解析　(1)圖中①表示構建基因表達載體,構建之前可以根據人胰島素基因的核苷酸序列設計引物,利用PCR技術對目的基因進行擴增。將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法。(2)過程②表示目的基因導入植物細胞,可用農桿菌轉化法(答基因槍法、花粉管通道法也可)。過程③表示動物的個體發育,此過程用到的技術手段有早期胚胎培養、胚胎移植。(3)由于乳腺細胞有內質網與高爾基體,能加工相關的蛋白質,而大腸桿菌沒有內質網和高爾基體,因此“胰島素羊”乳腺細胞分泌的胰島素具有生物活性,而轉基因“胰島素大腸桿菌”產生的胰島素無生物活性。知識歸納　不同受體細胞的轉化　　根據受體細胞不同,導入重組DNA分子的方法也不一樣,將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法;將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法;將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。9.(2020屆江蘇南京一模,32)(14分)乳腺炎和口蹄疫分別是由細菌和病毒引起的危害奶牛養殖業的兩種嚴重疾病。研究者利用生物技術培育出轉乳鐵蛋白肽(抗細菌)和人干擾素(抗病毒)基因的雙轉基因奶牛品種。如圖1為基因表達載體,圖2為培育流程。請據圖回答問題:,圖1圖2圖3(1)構建基因表達載體時需要用到的工具酶是　　　　　　　　。 (2)基因表達過程包括　　　　　　　　,圖1中一般能同時表達的基因是　　　　　　　　。新霉素抗性基因的作用是　　　　　　　　。 (3)圖2中研究者可利用　　　　　　　　技術篩選出干擾素基因成功表達的胚胎進行移植。 (4)若利用PCR技術增加目的基因的數量,由圖3可知,A、B、C、D四種單鏈DNA片段中應選取　　　　　　作為引物(DNA復制子鏈的延伸方向5'→3')。若上圖所示基因復制2次,則共需要這兩種引物各　　　　個;PCR程序中“適溫延伸”中的適溫是　　　　　　　　酶的最適溫度。 答案　(1)限制酶和DNA連接酶　(2)轉錄和翻譯　干擾素基因和新霉素抗性基因　便于篩選出含有目的基因的細胞　(3)抗原—抗體雜交　(4)B和C　3　Taq(耐高溫的DNA聚合)解析　(1)構建基因表達載體時需要用到的工具酶是限制酶和DNA連接酶。(2)基因表達過程包括轉錄和翻譯,據圖可知,干擾素基因與新霉素抗性基因均位于相同的啟動子和終止子之間,可同時轉錄。新霉素抗性基因的作用是便于篩選出含有目的基因的細胞。(3)牛乳鐵蛋白基因在成年牛的乳腺中才能表達,人干擾素基因可在牛全身細胞表達,因此篩選胚胎時可利用抗原—抗體雜交技術篩選干擾素基因成功表達的胚胎。(4)若利用PCR技術增加目的基因的數量,由圖3可知,DNA復制只能從5'到3',因此構建前利用PCR技術擴增干擾素基因時,A、B、C、D四種單鏈DNA片段中應選取B和C作為引物。若上圖所示基因復制2次,則共需要這兩種引物各3個;PCR程序中“適溫延伸”中的適溫是Taq(耐高溫的DNA聚合)酶的最適溫度。解題關鍵　明確牛乳鐵蛋白肽基因只在轉基因奶牛的乳腺細胞表達,人干擾素基因則可在全身細胞表達,據此可判斷篩選胚胎時應選擇的方法。10.(2020福建漳州二模,38)(11分)新型肺炎的病原體——新冠病毒,結構如圖所示(棘突、脂質膜、包膜成分都是含有蛋白質,它們分別是由病毒RNA的基因S、M、E的指導合成的)。根據相關知識回答下列問題:,(1)新冠病毒侵染過程中,棘突首先與細胞膜上受體結合,可能作為病毒的疫苗。如果利用基因工程研制新冠病毒疫苗,第一步是得到目的基因S,以用于后續操作,請簡述獲取目的基因S過程　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　?；蚬こ痰暮诵牟襟E是　　　　　　　　　　,完成該步驟所需要的酶有　　　　　　　　　　　　　　。理論上,目的基因S應該導入　　　　　　　　　　　　　　　　細胞中讓其表達,以得到合適的產物。 (2)制備出來的“產品”必須具備　　　　　　　　　　　、　　　　　　　　　　才能作為疫苗來使用。 (3)檢測新型肺炎的一般策略是檢測疑似病例是否攜帶新冠病毒。新冠病毒主要由核酸和蛋白質構成,如果檢測核酸,一般的方法是　　　　　　　;如果檢測其特異性蛋白,方法是　　　　　　　　　　。 答案　(1)提取病毒的RNA,反轉錄成對應DNA后,PCR技術擴增得到基因S(或對病毒基因S測序,然后人工合成基因S)　基因表達載體的構建　限制酶和DNA連接酶　哺乳動物(或大腸桿菌、哺乳動物)　(2)沒有傳染性和致病性(或:沒有“毒性”)　能引起對新冠病毒的特異性免疫　(3)探針法(或:PCR技術或分子雜交技術)　抗原—抗體雜交解析　(1)如果利用基因工程研制新冠病毒疫苗,第一步是得到基因S,以用于后續操作,由于新冠病毒的遺傳物質是RNA,故應提取病毒的RNA,反轉錄成對應DNA后,PCR技術擴增得到基因S(或對病毒基因S測序,然后人工合成基因S)?；蚬こ痰暮诵牟襟E是基因表達載體的構建,完成該步驟所需要的酶有限制酶和DNA連接酶。理論上目的基因S應該導入受體細胞如哺乳動物(或大腸桿菌、哺乳動物)細胞中讓其表達,才能得到合適的蛋白質產物。(2)制備出來的“產品”不能對接受疫苗的生物有害,還應使其產生抗體,即必須具備沒有傳染性和致病性(或:沒有“毒性”)、能引起對新冠病毒的特異性免疫才能作為疫苗來使用。(3)檢測新型肺炎的一般策略是檢測疑似病例是否攜帶新冠病毒,新冠病毒主要由核酸和蛋白質構成,如果檢測其核酸RNA,RNA可由DNA轉錄而來,一般用探針法(或分子雜交技術或PCR技術);如果檢測其表達的特異性蛋白,方法是抗原—抗體雜交。11.(2020浙江9+1高中聯盟期中,30)(8分)抗生素濫用導致的耐藥性細菌目前已成為一個嚴重的公共健康問題,近年來“超級細菌”等事件的發生更顯示出這一問題的嚴重性?？咕?AMPs)是一類具有廣譜抗菌性,且不易產生耐藥性的物質。為了改善抗菌肽的抗菌功能,常利用基因工程技術使抗菌肽在不同來源的宿主細胞內進行蛋白的重組表達。β-防御素是一種抗菌肽,構建β-防御素(β-defensin130)表達載體在大腸桿菌中表達。表達載體(pET-28a)和含有目的基因β-防御素的片段如圖,結合已知條件回答下列問題:(說明:Kanr和Ampr分別表示卡那霉素和氨芐青霉素抗性基因;promoter表示基因的啟動部位)(1)獲得含有目的基因的重組DNA分子,需用　　　和　　　　兩種酶分別切割表達載體和含有目的基因的片段,并用　　　　　酶將它們連接。 (2)把構建好的重組DNA分子導入受體細胞,用適宜濃度的氯化鈣處理受體細胞,增加細胞壁的通透性的目的是　　　　　　　　　。 (3)篩選含有目的基因β-防御素(β-defensin130)的受體細胞時,先將菌液涂布在含有　　　　　(抗生素)的培養基中培養,然后將所有菌落轉移至含有　　　　　(抗生素)的培養基中培養,最后挑選出目的菌落。 ,(4)在無菌操作下將目的單菌落用接種環取出,再用劃線法接種在斜面上,37℃培養24小時后,置于　　　冰箱中保存。 (5)若受體細胞為雙子葉植物,常用　　　　　　法將目的基因導入植物體細胞,再將體細胞進行組織培養,得到轉基因植物。 答案　(1)EcoRⅠ　XhoⅠ　DNA連接　(2)增加轉化的成功率　(3)卡那霉素　氨芐青霉素　(4)4℃　(5)農桿菌轉化解析　(1)結合題圖所示的酶切位點可知,為獲得含有目的基因的重組DNA分子,需要用EcoRⅠ和XhoⅠ兩種限制酶分別切割表達載體和含有目的基因的片段,并用DNA連接酶將它們連接。(2)氯化鈣處理受體細胞是為了增加細胞壁的通透性,增加轉化的成功率。(3)篩選含有目的基因的受體細胞時,先將菌液涂布在含有卡那霉素的培養基中培養,再將菌落轉移到含有氨芐青霉素的培養基中培養,最終挑選出目的菌落。(4)菌種置于4℃冰箱中保存。(5)雙子葉植物常用農桿菌轉化法將目的基因導入植物體細胞。12.(2020屆山東等級考模擬,25)(14分)基因定點整合可替換特定基因,該技術可用于單基因遺傳病的治療。苯丙酮尿癥是由PKU基因突變引起的。將正常PKU基因定點整合到PKU基因突變的小鼠胚胎干細胞的染色體DNA上,替換突變基因,該方法可用來研究該病的基因治療過程。定點整合的過程是從染色體DNA上突變PKU基因兩側各選擇一段DNA序列HB1和HB2,根據其堿基序列分別合成HB1和HB2,再將兩者分別與基因HSV-tk1、HSV-tk2連接,中間插入正常PKU基因和標記基因neor,構建出如圖所示的重組載體。重組載體和染色體DNA中的HB1和HB2序列發生交換,導致兩者之間區域發生互換,如圖所示。(1)構建重組載體時,常用的工具酶有　　　　　　　　　　　　　　　。該實驗用小鼠胚胎干細胞作為PKU基因的受體細胞以培育出轉基因小鼠,除了胚胎干細胞能大量增殖外,還因為胚胎干細胞　　　　　　　。 (2)為獲得小鼠的胚胎干細胞,可將小鼠囊胚中的　　　　取出,并用　　　　　　　處理使其分散成單個細胞進行培養,培養過程中大部分細胞會貼附在培養瓶的表面生長,這種現象稱為　　　　　　　。 (3)用圖中重組載體轉化胚胎干細胞時,會出現PKU基因錯誤整合。錯誤整合時,載體的兩個HSV-tk中至少會有一個與neor一起整合到染色體DNA上。已知含有neor的細胞具有G418的抗性,HSV-tk1、HSV-tk2的產物都能把DHPG轉化成有毒物質而使細胞死亡。轉化后的胚胎干細胞依次在含有G418及同時含有G418和DHPG的培養液中進行培養,在雙重選擇下存活下來的是　　　　　　　　　　的胚胎干細胞,理由:　  　。 (4)將篩選得到的胚胎干細胞培育成小鼠,從個體生物學水平檢測,若小鼠　　　　　　　　,說明PKU基因成功表達。 答案　(1)限制性核酸內切酶(或限制酶)和DNA連接酶　全能性強　(2)內細胞團　胰蛋白酶(或膠原蛋白酶)　細胞貼壁(或貼壁生長)　(3)PKU基因正確整合(或PKU基因定點整合)　在含有G418的培養液中培養時,不含neor的細胞全部死亡,含有PKU基因的細胞可以存活下來;在含有G418和DHPG的培養液中培養時,錯誤整合的細胞因含HSV-tk而死亡　(4)不患苯丙酮尿癥解析　本題涉及的學術情境為基因工程知識的遷移運用。(1)構建重組載體時,要用到基因的“剪刀”限制酶和基因的“針線”DNA連接酶。胚胎干細胞全能性強,可大量增殖,因此能作為轉基因技術的,受體細胞。(2)胚胎干細胞來源于早期胚胎或原始性腺,可以從囊胚中的內細胞團得到。分散成單個細胞需要用到胰蛋白酶或膠原蛋白酶。在動物細胞培養過程中,會出現貼壁生長和接觸抑制的現象。(3)根據題意可知,含標記基因neor的細胞具有抗G418的功能,因此不含neor的胚胎干細胞,不能在含有G418的培養液中生存;若基因錯誤整合,至少有一個HSV-tk與neor一起整合到染色體DNA中,形成含有HSV-tk和neor的胚胎干細胞,HSV-tk的產物能將DHPG轉化為有毒物質而使胚胎干細胞死亡。則在含有G418的培養液中培養時,不含neor的細胞全部死亡,含有PKU基因的細胞可以存活下來;在含有G418和DHPG的培養液中培養時,錯誤整合的細胞因含HSV-tk而死亡。因此,經過雙重選擇存活下來的都是正確互換、整合成功的細胞。(4)轉基因是否成功,最后還需要進行個體生物學水平上的檢測,若小鼠沒有表現出患苯丙酮尿癥,即可說明PKU基因成功表達。